Minyak paus minke yang diperas dingin mengurangi kolesterol LDL / VLDL yang bersirkulasi, oksidasi lipid, dan aterogenesis pada tikus yang kekurangan E apolipoprotein yang diberi makan diet tipe Barat selama 13 minggu
Latar belakang
Asam lemak tak jenuh ganda n3 rantai panjang (LC n3-PUFA) terkenal karena aktivitas anti-inflamasi dan dampaknya terhadap penyakit kardiovaskular. Cold-pressed whale oil (CWO) memiliki setengah jumlah LC n3-PUFA dibandingkan dengan cod liver oil (CLO). Namun, telah diamati efek menguntungkan yang lebih nyata pada penanda penyakit kardiovaskular dari asupan CWO dibandingkan dengan asupan CLO dalam studi intervensi manusia. Ekstrak dari CWO yang dirampas dari asam lemak juga menunjukkan efek antioksidan dan anti-inflamasi in vitro. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki apakah asupan diet tipe Barat (WD) tinggi lemak yang dilengkapi dengan CWO akan mencegah perkembangan lesi aterosklerotik pada tikus yang kekurangan apolipoprotein E (ApoE −/− ).
Metode
Tujuh puluh tikus ApoE −/− betina diberi makan WD yang mengandung 1% CWO, CLO atau minyak jagung (CO). Pembentukan lesi aterosklerotik, bobot tubuh dan jaringan, ekspresi gen hati bersama dengan kadar kolesterol LDL/VLDL serum, ox-LDL, status antioksidan total dan berbagai penyakit kardiovaskular serum/penanda proinflamasi dievaluasi. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS, dan uji Shapiro-Wilk dilakukan untuk menentukan distribusi variabel. Perbedaan statistik dinilai menggunakan One-Way ANOVA dengan uji post hoc Tukeys atau uji Kruskal-Wallis. Ekspresi gen relatif hati dianalisis dengan REST 2009 (V2.0.13).
Hasil
Tikus yang diberi CWO memiliki lebih sedikit lesi aterosklerotik di lengkung aorta dibandingkan dengan tikus yang diberi CO. Tingkat kolesterol LDL / VLDL dan kolesterol ox-LDL juga berkurang secara nyata sedangkan tingkat antioksidan total meningkat pada tikus yang diberi CWO dibandingkan dengan tikus yang diberi makan CO . Selain itu, tikus yang diberi makan CWO bertambah berat badannya lebih sedikit dan beberapa gen hati yang terlibat dalam metabolisme kolesterol diatur lebih tinggi dibandingkan dengan tikus yang diberi makan CO.
Kesimpulan
Dalam penelitian ini, tikus yang diberi WD yang dilengkapi dengan 1% CWO telah mengurangi pembentukan lesi aterosklerotik di lengkung aorta, mengurangi kolesterol LDL/VLDL serum dan kolesterol ox-LDL, meningkatkan status antioksidan total serum dan mengurangi berat badan dibandingkan dengan tikus. diberi makan WD yang dilengkapi dengan 1% CO.
Bahan pelengkap elektronik
Versi online artikel ini (10.1186/s12986-018-0269-8) berisi materi tambahan, yang tersedia untuk pengguna resmi.
Kata kunci: Aterosklerosis, Plak, Lesi, Balaenoptera acutorostrata , Minyak ikan paus, Lapisan lemak, Ekspresi gen, Kolesterol LDL, Kolesterol VLDL
Pergi ke:
Latar belakang
Aterosklerosis ditandai dengan lesi lipid arteri di intima arteri besar dan penyakitnya bisa diam atau tanpa gejala selama beberapa dekade. Namun, aterosklerosis adalah penyebab utama beberapa penyakit kardiovaskular lainnya (CVD) seperti angina tidak stabil, infark miokard, dan stroke. Akumulasi lipid bertahun-tahun di dinding pembuluh darah menyebabkan pembentukan plak dan penyempitan lumen. Pecahnya plak pada akhirnya dapat menyebabkan atherothrombosis akut yang mencegah aliran darah yang cukup ke paru-paru, jantung dan jaringan otak [ 1 , 2 ]. Hubungan antara aterosklerosis dan peradangan telah dijelaskan secara komprehensif [3-7 ] , dan beberapa sitokin dan kemokin merupakan kontributor utama dalam perkembangan aterosklerotik [ 8– 11 ]. Efek anti-inflamasi dari asam lemak tak jenuh ganda n3 rantai panjang (LC n3-PUFA) sudah diketahui dengan baik. Terutama asam eicosapentaenoic (EPA) dan asam docosahexaenoic (DHA) dan bagaimana mereka berkontribusi untuk mengurangi perkembangan aterosklerotik pada pasien koroner [ 12-17 ] . Ikan berminyak adalah sumber makanan EPA dan DHA yang baik. Ikan juga mengandung konstituen lain seperti protein, asam amino, peptida dan senyawa bioaktif yang dapat berkontribusi pada efek menguntungkan yang diamati setelah konsumsi ikan [ 18-20 ] .
Paus minke biasa ( Balaenoptera acutorostrata ) memakan krustasea dan ikan pelagis di Atlantik Utara [ 21 ], dan lapisan lemaknya yang tebal sangat penting untuk insulasi termal, daya apung, dan penyimpanan energi [ 22 ]. Lemak telah menjadi bagian penting dari makanan bagi penduduk asli di wilayah Arktik dan Subarktik selama berabad-abad. Dua dekade lalu, cold-pressed whale oil (CWO) dan cod liver oil (CLO) diberikan sebagai suplemen makanan untuk individu sehat sebagai bagian dari penelitian yang lebih besar [ 23 , 24]. Hasilnya menunjukkan bahwa kelompok CWO memiliki efek menguntungkan pada penanda CVD dan meningkatkan efek peradangan, juga jika dibandingkan dengan kelompok CLO. Komposisi asam lemak (FA) CWO dan CLO berbeda dalam jumlah LC n3-PUFA. Lemak paus memiliki 10,3% LC n3-PUFA, termasuk 3,3% EPA, 1,7% asam docosapentaenoic (DPA) dan 4,7% DHA sementara CLO memiliki 25,1% LC n3-PUFA, termasuk 9,5% EPA, 1% DPA, dan 13,5% DHA dalam CLO [ 24 ]. Baru-baru ini, kami menunjukkan dalam studi in vitro dengan CWO yang tidak mengandung asam lemak, bahwa CWO mengandung antioksidan yang dapat diekstraksi dan memiliki aktivitas anti-inflamasi yang terkait dengan senyawa yang sampai sekarang belum teridentifikasi [ 25 ].
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki apakah asupan diet tinggi lemak tipe Barat (WD) yang dilengkapi dengan CWO atau minyak ikan paus olahan (RWO) yang dikombinasikan dengan ekstrak dari lemak ikan paus akan mencegah perkembangan lesi aterosklerotik pada Defisiensi Apolipoprotein E. (ApoE −/− ) tikus.
Pergi ke:
Hewan percobaan dan perumahan
Tujuh puluh dua ApoE betina bebas patogen −/− -tikus (B6.129P2- Apoe tm1 Unc N11) dibeli dari Taconic (Taconic M&B, Ry, Denmark). Setelah tiba di fasilitas hewan lokal, semua mencit dialokasikan dan dialokasikan secara acak ke dalam 6 kelompok ( n  = 12) dengan jumlah kandang yang sama per intervensi ( n  = 4 kandang/diet). Karena penurunan berat badan selama aklimatisasi satu minggu, dua tikus dikeluarkan ( n = 11 pada kelompok RWO-I dan CWO). Pada awal percobaan, mencit berumur 6 minggu dengan kisaran berat badan 16 hingga 21 g. Mencit yang diberi air dan pakan pelet ad libitum selama 13 minggu disimpan dalam kandang berventilasi yang ditempatkan di ruangan yang sama di unit hewan laboratorium konvensional. Suhu dan kelembapan relatif adalah 21 °C dan 55% pada siklus siang/malam 12 jam (cahaya: 0600 hingga 1800 jam). Kandang dan alas tidur diganti seminggu sekali. Pada akhir penelitian, semua tikus diberi makan selama 3 jam sebelum eutanasia dengan inhalasi karbon dioksida. Darah diambil dengan tusukan jantung dan serum disiapkan dan dibekukan pada suhu -80 °C. Jaringan jantung, hati, ginjal, limpa dan adiposa dibedah, ditimbang, dibekukan dan disimpan pada suhu -80 °C.
Persiapan minyak makanan
Lemak beku segar dari paus minke biasa disediakan oleh Ellingsen Seafood AS (Skrova, Norwegia). Lapisan lemak digiling sekali sebelum sentrifugasi pada <2000×g (<40 °C). Setelah sentrifugasi, lapisan atas yang berminyak, selanjutnya disebut sebagai CWO dalam penelitian ini, dikumpulkan dan 250 g CWO diekstrak dalam 800 ml metanol/diklorometana (1:1). Setelah pemisahan fase, sebagian besar lipid (minyak) berada dalam fraksi yang mengandung diklorometana. Bagian yang lebih baik dari diklorometana dihilangkan dengan rotary evaporator dan pelarut yang tersisa dihilangkan selama pembilasan nitrogen selama 48 jam. Setelah ekstraksi CWO, minyak yang tersisa disebut sebagai RWO. Untuk fase metanol, mengandung lebih banyak senyawa polar yang diekstraksi dari CWO, sisa diklorometana dan minyak dihilangkan dengan rotary evaporator diikuti dengan ekstraksi cair-cair heptana 3 × 200 ml. Selanjutnya, metanol dalam fraksi ini diuapkan hingga hampir kering dan akhirnya dihilangkan dengan menyiram sampel dengan nitrogen selama 48 jam (ekstrak I). Sisa lemak paus setelah penghilangan awal lapisan atas minyak selanjutnya diekstraksi sesuai dengan protokol yang sama seperti untuk CWO. Karena tingkat minyak yang rendah dalam lemak yang diperas dingin, minyak ikan paus yang dimurnikan tidak dikumpulkan dari fraksi diklorometana ini. Ekstrak II (ekstrak lemak paus) juga dibilas dengan nitrogen selama 48 jam untuk menghilangkan semua sisa pelarut. Minyak dan ekstrak dibilas dengan nitrogen dan disimpan pada suhu -20 °C sebelum analisis lebih lanjut. CLO Komersial dibeli dari Orkla Health [ metanol dalam fraksi ini diuapkan hingga hampir kering dan akhirnya dihilangkan dengan menyiram sampel dengan nitrogen selama 48 jam (ekstrak I). Sisa lemak paus setelah penghilangan awal lapisan atas minyak selanjutnya diekstraksi sesuai dengan protokol yang sama seperti untuk CWO. Karena tingkat minyak yang rendah dalam lemak yang diperas dingin, minyak ikan paus yang dimurnikan tidak dikumpulkan dari fraksi diklorometana ini. Ekstrak II (ekstrak lemak paus) juga dibilas dengan nitrogen selama 48 jam untuk menghilangkan semua sisa pelarut. Minyak dan ekstrak dibilas dengan nitrogen dan disimpan pada suhu -20 °C sebelum analisis lebih lanjut. CLO Komersial dibeli dari Orkla Health [ metanol dalam fraksi ini diuapkan hingga hampir kering dan akhirnya dihilangkan dengan menyiram sampel dengan nitrogen selama 48 jam (ekstrak I). Sisa lemak paus setelah penghilangan awal lapisan atas minyak selanjutnya diekstraksi sesuai dengan protokol yang sama seperti untuk CWO. Karena tingkat minyak yang rendah dalam lemak yang diperas dingin, minyak ikan paus yang dimurnikan tidak dikumpulkan dari fraksi diklorometana ini. Ekstrak II (ekstrak lemak paus) juga dibilas dengan nitrogen selama 48 jam untuk menghilangkan semua sisa pelarut. Minyak dan ekstrak dibilas dengan nitrogen dan disimpan pada suhu -20 °C sebelum analisis lebih lanjut. CLO Komersial dibeli dari Orkla Health [ Sisa lemak paus setelah penghilangan awal lapisan atas minyak selanjutnya diekstraksi sesuai dengan protokol yang sama seperti untuk CWO. Karena tingkat minyak yang rendah dalam lemak yang diperas dingin, minyak ikan paus yang dimurnikan tidak dikumpulkan dari fraksi diklorometana ini. Ekstrak II (ekstrak lemak paus) juga dibilas dengan nitrogen selama 48 jam untuk menghilangkan semua sisa pelarut. Minyak dan ekstrak dibilas dengan nitrogen dan disimpan pada suhu -20 °C sebelum analisis lebih lanjut. CLO Komersial dibeli dari Orkla Health [ Sisa lemak paus setelah penghilangan awal lapisan atas minyak selanjutnya diekstraksi sesuai dengan protokol yang sama seperti untuk CWO. Karena tingkat minyak yang rendah dalam lemak yang diperas dingin, minyak ikan paus yang dimurnikan tidak dikumpulkan dari fraksi diklorometana ini. Ekstrak II (ekstrak lemak paus) juga dibilas dengan nitrogen selama 48 jam untuk menghilangkan semua sisa pelarut. Minyak dan ekstrak dibilas dengan nitrogen dan disimpan pada suhu -20 °C sebelum analisis lebih lanjut. CLO Komersial dibeli dari Orkla Health [ Minyak dan ekstrak dibilas dengan nitrogen dan disimpan pada suhu -20 °C sebelum analisis lebih lanjut. CLO Komersial dibeli dari Orkla Health [ Minyak dan ekstrak dibilas dengan nitrogen dan disimpan pada suhu -20 °C sebelum analisis lebih lanjut. CLO Komersial dibeli dari Orkla Health [26 ] sedangkan CO adalah minyak curah yang disediakan oleh produsen diet.
Tikus diberi makan enam WD tinggi lemak berbeda (dimodifikasi dari EF D-12079, ssniff Spezialdiäten GmbH ). Keenam diet dilengkapi dengan 1% dari enam minyak kaya PUFA yang berbeda seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Diet A adalah diet kontrol yang mengandung 1% CO, diet B mengandung 1% CLO komersial [ 26 ], diet C mengandung 1% RWO, diet D mengandung 1% RWO-I, diet E mengandung 1% RWO-II, dan diet F mengandung 1% CWO. Terlepas dari sumber PUFA, makanannya identik, namun untuk mengimbangi kandungan kolesterol CLO yang lebih tinggi dibandingkan dengan minyak makanan lain yang digunakan dalam penelitian ini, sejumlah kecil kolesterol ditambahkan ke dalam makanan CLO (1,47 g/kg vs 1,5 g/kg untuk sisa makanan, Tabel 1). Pakan percobaan disimpan pada suhu -20 °C dan pakan diganti setiap minggu.
Buka di jendela terpisah
Analisis plak aterosklerotik
Segera setelah drainase darah, semua tikus diperfusi melalui ventrikel kiri dengan saline steril (0,9%), sampai tidak ada sisa darah yang terlihat di perfusi (kira-kira perfusi 5 menit). Seluruh aorta (ascending aorta proksimal ke percabangan arteri iliaka) dibersihkan in situ dari lemak periadvential, dibedah dan difiksasi dalam larutan paraformaldehyde 1%. Akhirnya, aorta diwarnai dengan pewarnaan Oil Red O, dibuka secara longitudinal dan terpasang pada slide seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 27 ]. Setelah istirahat 48 jam, slide dipindai dengan pemindai resolusi tinggi. Area lesi dievaluasi menggunakan perangkat lunak ImageJ [ 28] dan luasnya aterosklerosis dilaporkan sebagai persentase dari luas total aorta tertentu atau daerah aorta yang ditempati oleh lesi aterosklerotik.
Ekstraksi RNA total
Setelah perfusi mencit, hati dikeluarkan, ditimbang dan dibekukan dalam nitrogen cair sebelum disimpan pada suhu -80 °C hingga ekstraksi. Seratus mg jaringan hati dihomogenkan dalam 1 ml Trizol (Life Technologies) dengan penggilingan manik (Precellys 24, Bertin Technologies). Sampel diinkubasi di atas es selama 30 menit diikuti dengan sentrifugasi 20 menit pada 12000 × g pada suhu 4 °C. Sampel diendapkan semalam dengan isopropanol dan disentrifugasi selama 21.000 × g selama 30 menit pada suhu 4 °C. Pelet dilarutkan dalam larutan penyimpanan RNA dan RNA disimpan pada suhu -80 °C hingga diproses lebih lanjut. Total konsentrasi RNA diukur menggunakan Qubit fluorometer 1.0 (Life Technologies) dan kualitasnya diuji dengan Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc). Faktor Integritas RNA adalah 7,6-9,3 untuk sampel yang digunakan.
Membalikkan transkripsi dan PCR real-time kuantitatif
Kit Transkripsi Terbalik cDNA kapasitas tinggi (4.368.813, Biosistem Terapan) digunakan untuk membuat 3 rangkap tiga transkriptase balik (50 ng RNA total dalam 20 μl). RT-PCR kuantitatif digunakan untuk menganalisis 4 μl cDNA per 20 μl reaksi menggunakan TaqMan® Fast Universal PCR Master mix (4.352.042, Applied Biosystems) dan dengan tes TaqMan® Gene Expression yang dirancang sebelumnya (File tambahan 1 : Tabel S1). Pelat 96-sumur dijalankan pada ABI Prism 7500 Fast cycler (Applied Biosystems) menggunakan profil amplifikasi yang telah ditentukan sebelumnya (95 °C 20s, 40 × 95 °C 3 s dan 60 °C 30s). Gen referensi endogen yang diekspresikan paling stabil, Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (Hprt1) dan TATA-Box Binding Protein ( Tbp), dipilih menggunakan TaqMan Array Mouse Endogenous Control Assay (4.426.701, Applied Biosystems). Rata-rata geometris dari gen referensi ini digunakan untuk menormalkan ekspresi gen. Kalibrator pelat antar dan kontrol tanpa-templat dimasukkan dalam semua pengujian.
Analisis serum
Kolesterol serum, kolesterol lipoprotein densitas rendah dan lipoprotein densitas sangat rendah (LDL/VLDL), glukosa, triasilgliserol (TAG), konsentrasi protein total, asam urat, asam lemak non-esterifikasi (NEFA; D07940, Dialab, Austria) dan total status antioksidan (TAS; NX2332 Randox Total Antioksidan Status, Randox Laboratories Ltd., UK) dianalisis menggunakan kit enzimatik konvensional dan bioanalyser MaxMat PLII (MaxMat PL, Montpellier, Prancis). Kecuali dinyatakan lain, semua kit berasal dari MaxMat PL (Montpellier, Prancis). LDL teroksidasi serum (Ox-LDL) dikuantifikasi dalam duplikat sesuai dengan instruksi pabrik dengan murine ELISA-kit (E90527Mu, USCN Life Science Inc., Texas, AS). Sampel serum dianalisis dalam duplikat untuk sitokin berikut: interferon gamma (IFNγ), interleukin 10 (IL-10), interleukin 1 beta (IL-1β), interleukin 2 (IL-2), interleukin 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), onkogen pengatur pertumbuhan kemoatraktan keratinosit (KC-GRO), dan tumor necrosis factor alpha (TNF-α). Analisis ini dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik menggunakan panel MSD Mouse Proinflammatory 1 V-Plex kit (MULTI-ARRAY®, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).
Analisis statistik
Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan IBM SPSS Statistics for Macintosh (Rilis 22.0.0.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, US). Uji Shapiro-Wilk dilakukan untuk menentukan distribusi variabel dan variabel yang tidak terdistribusi normal ditransformasi log sebelum analisis statistik. Perbedaan statistik dinilai menggunakan One-Way ANOVA dengan uji post hoc Tukeys atau uji Kruskal-Wallis. Ekspresi gen relatif dianalisis dengan REST 2009 (V2.0.13) [ 29 ]. Nilai p  <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Pergi ke:
Hasil
Kesehatan fisik umum dan penambahan berat badan tampak normal untuk semua tikus kecuali satu tikus yang diberi makan CO (di-eutanasia karena penurunan berat badan) selama 13 minggu dengan diet eksperimental. Asupan pakan harian rata-rata (g/tikus) adalah sama untuk semua 6 kelompok diet (Gambar. 1). Namun, tikus yang diberi CWO memperoleh berat badan lebih sedikit dibandingkan dengan tikus yang diberi CO2 (Gbr. 1). 2a). Bobot hati pada tikus yang diberi CWO dan RWO-II lebih rendah daripada bobot hati pada tikus yang diberi CO2 (Gambar. 2b). Perbedaan yang signifikan ini juga terdapat pada bobot hati relatif. Jumlah jaringan adiposa putih juga lebih rendah pada tikus yang diberi CWO dibandingkan dengan tikus yang diberi CO2 (masing-masing 1,44 g ± 0,12 vs 2,24 ± 0,2), namun tidak signifikan ( p  = 0,078). Tidak ada perbedaan nyata dalam ukuran jaringan antara kelompok jantung, ginjal atau limpa (Tabel 2). Kurva pertumbuhan untuk semua diet percobaan disajikan pada Gambar. 2c.
File eksternal yang menyimpan gambar, ilustrasi, dll. Nama objek adalah 12986_2018_269_Fig1_HTML.jpg
Gambar 1
Asupan pakan harian rata-rata (g / tikus) tikus betina yang kekurangan E apolipoprotein diberi makan diet tinggi lemak yang dilengkapi dengan minyak berbeda selama 13 minggu. Hasilnya disajikan sebagai rata-rata ± SD. CO ( n  = 11), CLO ( n  = 12), RWO ( n  = 12), RWO-I ( n  = 11), RWO-II ( n  = 12), CWO ( n  = 11)
File eksternal yang menyimpan gambar, ilustrasi, dll. Nama objek adalah 12986_2018_269_Fig2_HTML.jpg
Gambar 2
Berat badan akhir ( a ), berat hati ( b ) dan kurva pertumbuhan ( c ) apolipoprotein betina tikus yang kekurangan E diberi makan diet tinggi lemak yang dilengkapi dengan minyak perbedaan selama 13 minggu. Data disajikan sebagai plot kotak yang mewakili interval kepercayaan 95% (CI) untuk median ( a dan b ) dan sebagai batang yang mewakili rata-rata ± SD ( c ). a menunjukkan perbedaan yang signifikan dari CO (diet A), p  <0,05. CO ( n  = 11), CLO ( n  = 9), RWO ( n  = 11), RWO-I ( n  = 11), RWO-II ( n  = 12), CWO ( n  = 10)
Meja 2
Karakteristik serum dan organ pada apolipoprotein betina Tikus yang kekurangan E diberi diet tinggi lemak tipe Barat yang dilengkapi dengan minyak berbeda selama 13 minggu
Data disajikan sebagai rata-rata ± SD. CO ( n  = 11), CLO ( n  = 9), RWO ( n  = 11), RWO-I ( n  = 11), RWO-II ( n  = 12), CWO ( n  = 10). Tidak ada nilai untuk grup mana pun dalam tabel ini yang secara signifikan berbeda dari nilai dalam grup lain mana pun
